医学生物化学与分子生物学实验技术-(第2版) 本书特色
本教材介绍了生物化学与分子生物学的常用实验技术，包括大分子制备技术、分光光度技术、层析技术、电泳技术、离心技术、分子杂交技术、 PCR技术、测序技术、转基因技术、基因敲除技术、蛋白质组学技术、 EMSA和 ChIP技术、酵母双杂交技术等，以及实验技术的发展简史、技术创新、实验室管理等内容。在介绍技术的同时还配有相应的实验，以供学生在系统了解有关技术的同时进行实验练习。本教材既可以自成体系、独立成课使用，也可以与理论教材配套使用；既可以作为实验教材，也可以作为考研的复习材料。
本教材的主要对象为医学院校各专业的本科生，也可供其他类型院校的学生参考使用。
医学生物化学与分子生物学实验技术-(第2版) 内容简介
近年来，生物化学与分子生物学实验技术发展很快，使得该领域不断有新的发现。实验课也普遍受到重视，不仅增加了学时，而且单独开课，单独计算学分。实验课已不再是理论课的附属品，而是培养学生创新思维的有效途径。为了帮助医学生更好地学习掌握生物化学与分子生物学实验技术，我们编写了这本实验教材。全书共计 16章，以实验技术为主线编写，主要介绍大分子制备技术、分光光度技术、层析技术、电泳技术、离心技术、分子杂交技术、 PCR技术、测序技术、转基因技术、基因敲除技术、蛋白质组学技术、 EMSA和 ChIP技术、酵母双杂交等技术，另外还介绍有关技术创新和实验室管理等内容。这些内容基本反映了生物化学与分子生物学实验技术的大体面貌。在介绍实验技术的同时，还编写了一些实验项目，以方便学生通过实验练习更好地理解掌握有关技术。
医学生物化学与分子生物学实验技术-(第2版) 目录
第 1章 如何在分子水平研究生命 ....... 1第 1节分子实验技术简史 ...................... 1第 2节分子实验技术体系 ...................... 4一、生物分子的分析鉴定 ...................4二、生物分子的人工合成 ...................5三、生物分子的人工改造 ...................5四、生物分子的功能研究 ...................6第 3节分子实验技术应用 ...................... 7一、电泳技术在临床检验中的应用 ...............................................7二、 DNA重组技术在医药卫生领域的扩展 ...................................7三、基因诊疗技术在未来医学的前景 ...............................................8四、动物模型在医学研究中的重要地位 .........................................................9
第 2章 从组织中分离纯化生物大分子——大分子制备技术 .......... 10第 1节材料预处理及细胞的分离 ........ 11一、选择材料及预处理 .....................11二、细胞的分离 .................................11第 2节细胞破碎及细胞器分离 ............ 12一、细胞的破碎 .................................12二、细胞器的分离 .............................13第 3节大分子的分离纯化与测定 ........ 13一、蛋白质的分离纯化 .....................13二、核酸的分离纯化 .........................14三、蛋白质浓度的测定 .....................15四、核酸的浓度、纯度及完整性测定 .............................................17
第 4节生物大分子提纯后的处理 ........ 18一、大分子样品的浓缩 .....................18二、大分子样品的干燥 .....................18三、大分子样品的保存 .....................19第 5节实验练习 .................................... 20一、蛋白质的盐析与透析 .................20二、蛋白质含量测定 ........................21
第 3章 测定物质的吸收光谱——分光光度技术 .................................... 24第 1节 分光光度技术的基本原理 ........ 24一、光的性质 .....................................24二、光谱 .............................................25三、 Lambert-Beer定律 .....................26第 2节 分光光度计的基本结构 ............ 27一、光源 .............................................28二、分光系统 .....................................28三、样品室 .........................................29四、检测器 .........................................29五、显示器 .........................................30第 3节 常用分光光度计的使用方法 .... 30一、 721型分光光度计 ......................30二、 721e型分光光度计 ....................31三、 722s型分光光度计 ....................31四、 SP-756紫外 -可见分光光度计 ...31第 4节 分光光度技术的应用 ................ 31一、溶液的定性分析 .........................32二、溶液的定量分析 .........................32第 5节 实验练习 .................................... 33一、蛋白质的定量测定 .....................33二、脲酶 Km值测定 ..........................37
三、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（赖氏法） ...........................40四、血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法） ................................42五、激素对血糖浓度变化的影响 .....43六、血浆高密度脂蛋白 -胆固醇的测定 .........................................45七、紫外分光光度法检测核酸的浓度及纯度 .............................46
第 4章 将混合物中各种组分分开——层析技术 .................................... 48第 1节 层析技术概述 ............................ 48一、层析技术的形成和发展 .............48二、层析技术的基本原理 .................49三、层析技术的分类 .........................49四、层析技术的基本要求 .................50第 2节 吸附层析 .................................... 50一、吸附层析的原理 .........................50二、吸附层析的操作 .........................50第 3节 分配层析 .................................... 52一、纸层析的原理 .............................52二、纸层析的操作 .............................52第 4节 凝胶过滤层析 ............................ 54一、凝胶过滤层析的原理 .................54二、凝胶过滤层析的特征常数 .........54三、凝胶过滤层析的常用介质 .........55四、凝胶过滤层析的操作 .................56五、凝胶过滤层析的应用 .................57第 5节 离子交换层析 ............................ 57一、离子交换层析的原理 .................57二、离子交换剂 .................................58三、离子交换层析的操作 .................59四、离子交换层析的应用 .................61第 6节 亲和层析 .................................... 61一、亲和层析的原理 .........................61二、亲和层析的操作 .........................62第 7节 实验练习 .................................... 63一、氨基酸的分离鉴定——纸层析法 .............................................63
二、转氨酶的活性鉴定——薄层层析法 .............................................64三、核苷酸的分离——离子交换柱层析法 .........................................65四、胰蛋白酶的分离纯化——亲和层析法 .........................................67五、血清蛋白质的层析分离——分子筛层析法 .............................68
第 5章 分离带电颗粒的有效手段——电泳技术 .................................... 69第 1节 电泳技术概述 ............................ 69一、电泳技术的形成和发展 .............69二、电泳技术的基本原理 .................70第 2节 影响电泳的因素 ........................ 71一、溶液的 pH...................................71二、缓冲液的离子强度 .....................71三、电场强度 .....................................72四、电渗作用 .....................................72第 3节 常用电泳技术 ............................ 72
一、纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 .............................................72二、凝胶电泳 .....................................73三、等电聚焦电泳 .............................75四、双向电泳 .....................................76五、核酸电泳 .....................................77六、印迹转移电泳 .............................79第 4节 实验练习 .................................... 79
一、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 .............................................79二、血清乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳 .................................81三、血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 ...........................................82四、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 .........83五、 DNA琼脂糖凝胶电泳 ...............86六、限制性内切酶对质粒 DNA酶切产物的电泳鉴定 .................87 VII …………目 录
第 6章 利用离心场沉降大分子——离心技术 .................................... 90第 1节离心技术的基本原理 ................ 90一、颗粒沉降的原理 .........................90二、沉降系数 .....................................91三、相对离心力 .................................91第 2节 离心机的类型及操作规程 ........ 91一、离心机的类型 .............................91二、制备型离心机 .............................92三、分析型离心机 .............................94四、离心操作的注意事项 .................94第 3节 制备型超速离心的分离方法 .... 95一、差速沉降离心法 .........................95二、密度梯度区带离心法 .................95三、等密度梯度区带离心法 .............96第 4节 实验练习 .................................... 96一、肝糖原的提取和鉴定 .................96二、酪蛋白的制备 .............................97三、动物肝脏 DNA的提取 ..............98四、酵母 RNA的提取及成分鉴定 ...........................................100五、质粒 DNA的提取与鉴定 ........101六、感受态细菌的制备及质粒 DNA的转化 .............................104七、蔗糖密度梯度离心分离病毒 ...........................................106
第 7章 利用碱基互补探查核酸序列——分子杂交技术 ............ 109第 1节 核酸分子杂交的基本原理 ...... 109一、变性与复性 ...............................109二、建立在 DNA变性与复性基础上的核酸杂交技术 ...................110第 2节 核酸分子杂交的主要类型及程序 ...........................................111一、固相杂交的支持物 ...................111二、常用的转移方法 .......................112三、固相杂交的基本程序 ...............112四、固相杂交的主要类型 ...............113第 3节 核酸探针的分类和标记 .......... 114一、核酸探针的分类 .......................114二、核酸探针的标记 .......................115第 4节 实验练习 .................................. 117一、 Southern杂交 ...........................117二、 Northern杂交 ...........................118三、组织原位杂交 ...........................120四、斑点杂交 ...................................121
第 8章 微量 DNA的体外扩增—— PCR技术 ................................. 123第 1节 PCR技术概述 ......................... 123一、基本原理 ...................................123二、主要步骤 ...................................123三、主要特点 ...................................124第 2节 PCR的反应体系及操作 ......... 125一、 PCR反应体系 ..........................125二、 PCR的操作及注意事项 ..........125三、 PCR反应条件的优化 ..............127四、 PCR产物的检测分析 ..............128第 3节 PCR的衍生技术 ..................... 128一、逆转录 -PCR.............................128二、实时荧光定量 PCR ..................129三、特殊 PCR ..................................130第 4节 PCR技术的应用 ..................... 132一、分子生物学领域 .......................132二、临床医学领域 ...........................133三、其他领域 ...................................134第 5节 实验练习 .................................. 134逆转录 PCR ......................................134
第 9章 阅读遗传天书的**步——测序技术 .................................. 137第 1节 DNA测序的基本原理 ............ 137第 2节 DNA测序的常用方法 ............ 138一、酶学法——双脱氧链终止法 .......................................138二、化学（裂解）法—— Maxam-Gilbert测序法 ..........................140
三、酶学法与化学法的比较 ...........141第 3节 DNA测序自动化 .................... 143第 4节实验练习 .................................. 144双脱氧链终止法测定 DNA序列 ....144
转基因技术 ........................... 147第 1节转基因技术概述 ...................... 147一、转基因动物技术的原理 ...........147二、转基因动物技术的成果 ...........148第 2节建立转基因动物的方法 .......... 149一、目的基因的制备 .......................149二、转基因动物的制备方法 ...........149三、转基因小鼠 ...............................156第 3节转基因动物的应用 .................. 156
一、研究基因的结构和功能及其表达与调控 ...............................156二、建立人类疾病动物模型 ...........157三、研究人类疾病基因治疗 ...........157四、利用转基因动物生产生物活性蛋白 ...................................157五、利用转基因动物生产人用器官移植的供体 .......................158六、利用转基因技术改良动物品种和生产性能 .......................158第 4节转基因的安全性问题 .............. 159一、转基因生物的安全性 ...............159二、转基因食品的安全性 ...............159第 5节实验练习 .................................. 160一、转基因动物技术中外源基因的制备 .......................................160二、显微注射 ...................................161
第 11章 置换生物体的某种基因——基因打靶技术 ....................... 165第 1节基因敲除技术概述 .................. 165一、基因敲除技术的建立和发展 ...........................................165二、基因敲除的基本原理 ...............167第 2节基因敲除的方法及进展 .......... 170一、条件性基因敲除法 ...................170二、诱导性基因敲除法 ...................171三、利用随机插入突变进行基因敲除 ...........................................171第 3节基因敲除小鼠的制备过程 ...... 174一、目标载体的构建 .......................174二、 ES细胞培养 .............................174三、 ES细胞的转化 .........................175四、挑克隆 .......................................175五、抗性 ES细胞克隆的冻存 ........175六、 ES细胞基因组 DNA的提取 ...........................................175七、克隆的分析和鉴定 ...................175八、染色体分析 ...............................176九、嵌合体小鼠的制备 ...................176十、品系的建立 ...............................176第 4节基因敲除技术的应用及缺陷 ... 177一、基因敲除技术的应用 ...............177二、基因敲除技术的缺陷 ...............178
第 12章 21世纪的生命科学技术——蛋白质组学技术 ................... 180第 1节 蛋白质组学概论 ...................... 180一、蛋白质组学 ...............................180二、蛋白质组学研究的策略和范围 ...........................................182三、蛋白质组学发展趋势 ...............182第 2节 蛋白质组学技术 ...................... 183一、样品制备 ...................................183二、样品分离技术 ...........................184三、样品鉴定技术 ...........................190第 3节 蛋白质组生物信息学 .............. 195第 4节 实验练习 .................................. 196一、家兔血清蛋白质组二维凝胶电泳技术的建立 .......................196二、正常人尿蛋白质组学研究 .......198
第 13章 蛋白质与核酸相互作用分析 ——EMSA和 ChIP技术 .....200第 1节 电泳迁移阻滞实验（EMSA）... 200 目 录IX …………一、电泳迁移阻滞实验（ EMSA）的基本原理 ...............................200二、电泳迁移阻滞实验（ EMSA）的基本操作步骤 .......................200第 2节 染色质免疫沉淀（ ChIP）技术 .......................................... 202一、染色质免疫沉淀（ ChIP）技术的基本原理 ...............................202二、染色质免疫沉淀（ ChIP）技术的基本操作步骤 .......................202第 3节 实验练习 .................................. 204一、经 EMSA验证姜黄素可减少 B淋巴细胞核中 NF-κB的量 .....204二、经 ChIP验证姜黄素可减少 B淋巴细胞核中 NF-κB的量 .....207
第 14章 蛋白质和蛋白质相互作用分析——酵母双杂交等技术 ....211第 1节 概述 .......................................... 211一、蛋白质相互作用的分子结构基础 ...........................................211二、蛋白质相互作用分析的意义 ...212三、相互作用蛋白质组学的研究技术平台 ...................................213第 2节 酵母双杂交技术 ...................... 215一、酵母双杂交系统的原理 ...........215二、酵母双杂交系统的应用 ...........216三、酵母细胞内的高通量酵母双杂交 .......................................216四、酵母双杂交系统的几个版本 ...216五、酵母双杂交系统的假阳性问题 ...........................................217
第 3节 其他常用技术 .......................... 217一、细菌双杂交技术 .......................217二、噬菌体展示技术 .......................218三、依赖亲和力筛选相互作用蛋白质的技术 ...........................219四、蛋白质芯片技术 .......................221第 4节 实验练习 .................................. 222
一、酵母双杂交技术筛选 TRAC-1相互作用蛋白 ...........................222二、 GST融合蛋白沉降技术筛选 RNF114相互作用蛋白 ............226
第 15章 科学发展的不竭源泉——技术创新 .................................... 230第 1节 “三性”实验 ............................ 230一、“三性”实验的概念 .................230二、“三性”实验的特点和意义 .....230三、实验教学体系的改革 ...............231四、“三性”实验的基本要求 .........232五、“三性”实验的一般程序 .........232六、“三性”实验的选题原则 .........232七、“三性”实验的实施及评估 .....233第 2节 实验练习 .................................. 233
一、酵母蔗糖酶的纯化及性质研究 ...........................................233二、猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 ...........................................238三、 DNA重组实验 .........................241
实验室管理 ...................................249
第 1节实验室规则 .............................. 249第 2节实验用品的清洗 ...................... 250一、玻璃仪器的清洗 .......................250二、塑料器皿的清洗 .......................251三、实验器皿的干燥与消毒 ...........251四、常用洗涤液及其配制 ...............251第 3节实验标本的制备 ...................... 252一、血液样品的制备与保存 ...........252二、尿液标本的收集与保存 ...........253三、组织样品的制备与保存 ...........253第 4节实验仪器的使用 ...................... 254一、刻度吸管的使用 .......................254二、微量进样器的使用 ...................255三、单道可调式移液器的使用 .......256四、蒸汽压力灭菌器的使用 ...........256
五、酸度计的使用 ...........................256六、干燥箱和恒温箱的使用 ...........258七、电热恒温水浴锅的使用 ...........259第 5节实验数据的处理 ...................... 259一、列表法 .......................................259二、作图法 .......................................260三、少量实验数据的处理 ...............261四、实验误差和提高实验准确度的方法 .......................................261第 6节实验报告的书写 ...................... 263一、实验记录 ...................................263
一、一般化学试剂的分级及配制的注意事项 ...............................264二、实验室中常用酸碱的密度和浓度 ...........................................266三、常用缓冲溶液及配制方法 .......266四、溴化乙锭溶液的净化处理 .......271五、离心机转数与相对离心力的换算 ...........................................272六、硫酸铵饱和度的常用表 ...........273七、元素相对原子质量表 ...............275
二、实验报告 ...................................263参考文献 ...................................................277 第 7节常用实验数据 .......................... 264
